أدوات تقني الجينات
إنزيمات القطع
تستجيب البكتيريا عن طريق إنتاج إنزيمات تسمّى إنزيمات القطع Restriction enzymes عندما تهاجمها فيروسات تسمّى الفيروسات آكلة البكتيريا (الفاجات) Phages – Bacteriophages. وهذه فئة من الإنزيمات التي تحد من العدوى الفيروسية عن طريق تقطيع DNA الفيروسي إلى أجزاء أصغر لتحطيمه. وهي تقوم بذلك عن طريق قطع العمود الفقري سكر – فوسفات في أماكن محددة في داخل جزيء DNA، وليس في نهايتَيه، لذا تسمّى إنزيمات القطع إندونيوكلييز Restriction endonuclease .enzymes
يستهدف كل إنزيم موقع قطع Restriction site، وهو تتابع محدّد من أربع إلى ست قواعد على سبيل المثال، إنزيم القطع المسمّى BamHI، يقطع DNA الفيروسي عند التتابع GGATCC على الشريط ‘5 إلى ‘3 والتتابع المكمل CCTAGG على الشريط ‘3 إلى ‘5. للعديد من مواقع القطع تتابعات متناظرة Palindromic sequences (يكون التتابع نفسه عندما يقرأ من كلا الاتجاهين). وطبيعيّ أن تحمي البكتيريا DNA الخاص بها سواء من التغيير الكيميائي لقواعده، أو عدم وجود مواقع قطع فيه.
يمكن أن يقطع إنزيم القطع بطريقة مستقيمة عبر العمود الفقري سكر- فوسفات لتكوين نهايات مستقيمة، أو كما هو
مبيّن في الشكل ٣-١، بطريقة متعرّجة لتكوين ((نهايات لاصقة))، تاركا أجزاء قصيرة من قواعد غير مزدوجة. ويمكن عند هذه النهايات اللاصقة تكوين روابط هيدروجينية مع تتابع القواعد المكملة على أجزاء أخرى من DNA المقطوع. عندما يُقطع شريط طويل بهذه الطريقة يتكوّن مزيج من أجزاء مختلفة الطول، ويعمل تقني الجينات على فصل هذه الأجزاء تبعًا لأطوالها باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي. يمكن بعد ذلك تكوين نسخ عديدة من جزء DNA المستهدف باستخدام تفاعل البوليميريز المتسلسل (Polymerase chain reaction) (PCR). (فصل وتضخيم DNA).
سُمّيت إنزيمات القطع باختصارات تشير إلى مصدرها (الجدول ٣-١). أضيفت الأرقام الرومانية للتمييز بين
الإنزيمات المختلفة من المصدر نفسه. على سبيل المثال، ECORI تأتي من الأشريكية القولونية Escherichia coli
(سلالة RY13)، وكانت الأولى التي حددت من مصدرها.
إنزيم ترانسكريبتيز العكسي
يحتوي DNA الكروموسومي في جينات حقيقية النواة على تتابع مُشَفّر من القواعد (إكسونات) وتتابع غير مُشَفّر
(إنترونات). يُنسخ DNA إلى RNA في النواة، ويقطع RNA إلى أجزاء. وبعد عملية الربط تستخدم الإكسونات فقط من
RNA في تكوين mRNA، الذي يغادر النواة. ولتجنب استخدام DNA الكروموسومي بالإنترونات والإكسونات، يستخدم
التقنيون جزيء mRNA من السيتوبلازم، كقالب لصنع DNA، وهذا أصبح ممكنًا بعد اكتشاف إنزيم ترانسكريبتيز
العكسي Reverse transcriptase الذي يوجد في فيروسات RNA.
ويستخدم هذا الإنزيم شريط mRNA المفرد ونيوكليوتيدات DNA الحرة لتكوين شريط DNA مفرد (Single-stranded
DNA). ثم يُستخدم إنزيم DNA بوليميريز لبناء عديد نيوكليوتيد مكمل لشريط DNA، مكوّنًا DNA مكمل مزدوج
الشريط (Double-stranded complementary DNA)، ويعبر عنه اختصارًا CDNA (الشكل ٣-٢).
بناء DNA اصطناعيًا
يتمكن العلماء من بناء الجينات، وذلك باستخدام الشيفرة الجينية ، وحتى بناء الجينومات Genomes الكاملة مباشرة من نيوكليوتيدات DNA، من دون استخدام قوالب DNA الكروموسومي أو mRNA. تستطيع أجهزة بناء DNA تكوين أجزاء DNA قصيرة اعتمادًا على تتابع النيوكليويتدات المحفوظ في الحاسوب، والذي يتم اختباره اعتمادًا على تتابع الأحماض الأمينية التي تنتج منه. يتم ربط قطع DNA القصيرة معًا لتكوين تتابع طويل من النيوكليوتيدات، والذي يتم إدخاله في البلازميدات ليستخدم في الهندسة الجينية. وقد استخدمت هذه التقنية لتكوين جينات جديدة تستخدم على سبيل المثال، في تكوين اللقاحات. كما استخدمت لتكوين جينومات بكتيريا صناعية تحتوي على مليون زوج من القواعد.
النواقل
إدخال جين في بلازميد ناقل تستخدم النواقل لوضع الجزء المرغوب فيه من DNA الذي يحتوي على جين واحد أو أكثر داخل خلية مضيفة. أحد أنواع النواقل هو البلازميد Plasmid ، وهي قطع حلقية صغيرة من أشرطة DNA مزدوجة. توجد البلازميدات طبيعيًا في البكتيريا، والتي غالبًا ما تحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية. ويمكن تبادلها بين البكتيريا من النوع نفسه،
وحتى بين البكتيريا من أنواع مختلفة. فإذا أدخل مهندس جيني قطعة من DNA في بلازميد، يمكن استخدام هذا البلازميد لنقل DNA إلى خلية البكتيريا.
يمكن الحصول على البلازميدات عن طريق معالجة البكتيريا بالإنزيمات لتفكيك جدرانها الخلوية. ثم توضع في
جهاز الطرد المركزي، حيث يجري تدويرها بسرعة كبيرة، ما يؤدي إلى فصل البلازميدات الحلقية الكبيرة نسبيًا عن
البلازميدات الأصغر بكثير.
يُستخدم إنزيم القطع لفتح DNA البلازميد الحلقي (الشكل ٣-٤). ويجب أن يُستخدم الإنزيم نفسه في قطع الجين
المطلوب، لتصبح النهايات اللاصقة لكل من الجين و DNA البلازميد مكملة لبعضها (الشكل ٣-١). إذا استُخدم إنزيم
قطع يعطي نهايات مستقيمة، فسيحتاج نهايات لاصقة ترتبط بكل من الجين و DNA البلازميد.
تمزج البلازميدات المفتوحة وأجزاء DNA التي تحتوي على الجين المطلوب معًا، حيث ترتبط بعض النهايات اللاصقة
على البلازميدات مع النهايات اللاصقة على DNA. والعديد منها ببساطة يعود إلى وضعه الطبيعي (حلقة مغلقة) من
دون دمج DNA. يربط إنزيم DNA لايجيز معًا العمود الفقري سكر- فوسفات في DNA والبلازميد (الوحدة الأولى،
الموضوع ١-٢، تضاعف DNA). حيث يقوم الإنزيم بذلك عن طريق تحفيز تكوين روابط فوسفات ثنائية الإستر، وهذا
يكوّن حلقة مغلقة من أشرطة DNA المزدوجة المحتوية على الجين الجديد، فيتكون البلازميد معاد التركيب. يمكن
تعديل البلازميدات البكتيرية لإنتاج نواقل، ويمكن أيضًا إنتاج البلازميدات اصطناعيًا.
إدخال البلازميدات إلى البكتيريا
تتمثل الخطوة التالية للعملية في جعل البكتيريا تمتص البلازميدات. توضع البكتيريا والبلازميدات أولًا في محلول
يوجد فيه تركيز عالٍ من أيونات الكالسيوم، ثم يبرد المزيج ويُعرض لصدمة حرارية؛ فيزيد ذلك من احتمال عبور
البلازميدات عبر غشاء سطح خلية البكتيريا. نسبة قليلة من البكتيريا، ربما %1، تمتص البلازميدات معادة التركيب،
فيقال إنها عُدّلت Transformed. والبقية تمتص البلازميدات المغلقة من دون جين مدمج بها، أو لا تمتص أي بلازميد
على الإطلاق.
التعرف على البكتيريا ذات DNA معاد التركيب
من المهم تحديد البكتيريا التي عُدّلت بنجاح ليمكن استخدامها في تكوين البروتين المشفر من الجين. كان هذا الأمر
يتم سابقًا عن طريق نشر البكتيريا على صفائح آجار Agar تحتوي كل منها على مضاد حيوي. وقد تراجع الاهتمام
بهذه التقنية، واستبدلت بطرائق أبسط لتحديد البكتيريا المعدلة باستخدام العلامات الجينية.
ينسخ DNA بوليميريز في البكتيريا البلازميدات، ثم تنقسم البكتيريا بالانشطار الثنائي، بحيث تحتوي كل خلية ناتجة
على عدة نسخ من البلازميد. يعرف إنتاج عدة نسخ من البلازميد معاد التركيب باسم الاستنساخ الجيني Gene
cloning، وهذه إحدى الطرائق لإنتاج عدة نسخ من الجين للاستخدام في الهندسة الجينية أو الأبحاث. تنسخ البكتيريا
الجين الجديد إلى mRNA لتستخدمه في الترجمة لتكوين بروتين يسمّى البروتين معاد التركيب (الشكل ٣-٥).
إنسولين الإنسان معاد التركيب
ينتج أحد أنواع مرض السكري من عدم قدرة البنكرياس على إنتاج الإنسولين (الوحدة الرابعة: الاتزان الداخلي،
الموضوع ٤-٤، التحكم في تركيز الجلوكوز في الدم). وقد كان مرضى هذا النوع من السكري، قبل أن يتوافر الإنسولين
من البكتيريا المعدلة جينيًّا، يعالجون بإنسولين مستخلص من بنكرياس الخنازير أو الماشية. وفي السبعينات من
القرن الماضي، بدأت شركات التقنية الجينية الحيوية العمل على فكرة إدخال جين إنسولين الإنسان في خلية
البكتيريا، ثم استخدام خلية البكتيريا في إنتاج الإنسولين. وقد جربوا لذلك عدة طرائق مختلفة، لينجحوا أخيرًا في
ثمانينيات القرن الماضي، وأصبح إنسولين الإنسان معاد التركيب متوافرًا بدءًا من العام 1983 م. يبيّن الشكل ٣-٥
طريقة إنتاج إنسولين الإنسان معاد التركيب.
واجه العلماء مشكلات في تحديد موقع الجين الذي يشفر لإنسولين الإنسان وعزله عن بقية DNA في خلية الإنسان.
لذا، وبدلًا من قطع الجين من الكروموسوم المرتبط به، استخلص العلماء mRNA الإنسولين من خلايا بيتا (B)
البنكرياسية. وهذه هي الخلايا الوحيدة التي تعبّر عن جين الإنسولين وتحتوي على كمية كبيرة من mRNA للإنسولين.
اُستُخْدِم mRNA كقالب للنسخ العكسي لتكوين شريط DNA مفرد. ثم استُخدمت جزيئات DNA المفردة كقالب لإنزيم
DNA بوليميريز لتكوين DNA مزدوج (الشكل ٣-٢). وبهذه الطريقة حصل مهندسو الجينات على جينات إنسولين يمكن
إدخالها في البلازميدات لتعديل بكتيريوم الأشريكية القولونية.
يُصنّع إنسولين الإنسان معاد التركيب حاليًّا في خلايا خميرة معدلة جينيًّا أو في خلايا حيوانية بدل خلايا البكتيريا.
ويعود ذلك إلى أن الخلايا حقيقية النواة تحتوي على جهاز جولجي حيث يمكن تجميع وثنّي سلسلتَي عديد ببتيد
الإنسولين بشكل صحيح. الميزة الرئيسية لهذا الإنسولين معاد التركيب أنه متوافر ومتاح لتلبية الطلب المتزايد.
فلا يعتمد الحصول على الإنسولين على عوامل مثل توفر البنكرياس الحيواني. كما أن هذا الإنسولين هو إنسولين
إنسان بدلا من إنسولين من نوع آخر، والذي لا يكون مطابقًا كليًا.
عمل مهندسو الجينات على تغيير تتابع نيوكليوتيدات جين الإنسولين لتكوين جزيئات بتسلسل أحماض أمينية مختلفة
قليلا. هذه الجزيئات المماثلة من الإنسولين لها خصائص مختلفة. على سبيل المثال، قد يعمل بعضه بشكل أسرع،
ويكون من المفيد تناوله قبل الوجبة مباشرة (انظر الصورة ٣-٢). وقد يعمل بعضه بشكل أبطأ خلال فترة 8 – 24 ساعة،
ويكون بالتالي مفيدًا في الحفاظ على تركيز إنسولين الدم قريبًا من الثبات بحيث لا ينقص كثيرًا. يتناول كثير من مرضى
السكري كلا هذَين النوعين من الإنسولين معاد التركيب في الوقت نفسه.
تُستخدم العلامات الجينية Genetic markers لتحديد البكتيريا المعدلة جينيًا. وتُستخدم الجينات المقاومة للمضادات الحيوية Antibiotic-resistance genes كعلامات بمعدل أقل في الوقت الحاضر لتقليل خطر البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، ويستعيض العلماء عن ذلك، باستخدام جينات تشفر للإنزيمات المنتجة للمواد المتوهجة Fluorescent، على سبيل المثال، الإنزيمات التي تم الحصول عليها من قنديل البحر تصنع بروتينًا يسمّى GFP (البروتين المتوهج الأخضر Green
fluorescent protein)، والذي يتوهج باللون الأخضر في الضوء فوق البنفسجي. يُدخَل جين الإنزيم في البلازميدات، لذا كل ما يجب القيام به لتحديد البكتيريا التي امتصت البلازميد معاد التركيب، هو تسليط الضوء فوق البنفسجي عليها. فتلك التي تتوهج باللون الأخضر هي البكتيريا المعدلة جينيًا. يمكن استخدام العلامة الجينية نفسها في العديد من الكائنات الحية (الصورة ٣-٣).
يُستخدم إنزيم بيتا جلوكورونيديز β-glucuronidase (GUS)، والذي يؤخذ من الأشريكية القولونية، كعلامة جينية أخرى. عندما تُحتضن أي خلية معدّلة جينيًّا تحتوي على الإنزيم – مع بعض المواد المتفاعلة عديمة اللون أو غير المتوهجة، يمكن للإنزيم أن يحوّلها إلى نواتج ملوّنة أو متوهجة. وهذا يفيد بشكل خاص في الكشف عن نشاط الجينات التي يتم إدخالها في النباتات مثل نبات الندية Sundew في الصورة ٣-٤.
المحفزات
تحتوي البكتيريا على العديد من الجينات المختلفة التي تصنع العديد من البروتينات المختلفة. لكن لا يتم تشغيل كل الجينات معًا. تصنع البكتيريا فقط البروتينات المطلوبة في الظروف التي تنمو فيها. على سبيل المثال، تصنع بكتيريا الأشريكية القولونية إنزيم بيتا (β)- جلاكتوسيديز فقط عندما تنمو في وسط يحتوي على لاكتوز ولا يتوافر فيه جلوكوز (انظر الوحدة ٢، الموضوع ٢-٦ التحكم في التعبير الجيني).
يتم التحكم في التعبير عن الجينات، مثل تلك الموجودة في أوبرون Lac، عن طريق محفز Promoter، وهو منطقة في DNA يرتبط بها RNA بوليميريز عند بداية النسخ. ولكي يتم التعبير عن الجين، يجب إدخال المحفز المناسب إلى البكتيريوم. عندما عُدلت البكتيريا لأول مرة لإنتاج الإنسولين، أدخل جين الإنسولين إلى جوار جين إنزيم بيتا (β)- جلاكتوسيديز، فتشاركا المحفز
نفسه (انظر الرسم التخطيطي لأوبرون Lac في الشكل ٢-١٠). يعمل المحفز على تشغيل جين الإنسولين عندما تحتاج البكتيريا إلى أيض اللاكتوز، وبالتالي تصنع البكتيريا كلا من بيتا (β)- جلاكتوسيديز وإنسولين إنسان عندما تنمو في وسط غذائي يحتوي على اللاكتوز وليس الجلوكوز.
يسمح المحفز لإنزيم RNA بوليميريز بالارتباط مع DNA، والتأكد أيضًا من أنه مَيَّزَ أيًّا من شريطي DNA هو الشريط القالب. وفي التتابع النيوكلوتيدي لمنطقة المحفز، توجد نقطة بدء النسخ، وهي أول نيوكليوتيد من الجين يتم نسخه.
بهذه الطريقة، يمكن القول إن المحفز يتحكم في التعبير عن الجين، ويتأكد من وجود مستوى عال من التعبير الجيني.
تذكّر أن البروتينات المعروفة باسم عوامل النسخ في خلايا حقيقية النواة ضرورية للارتباط بمنطقة المحفز أو RNA
بوليميريز قبل بدء النسخ (الوحدة الثانية، الموضوع ٢-٦، التحكم في التعبير الجيني).
