فصل وتضخيم DNA

فصل وتضخيم DNA

تفاعل البوليميريز المتسلسل
يُستخدم تفاعل البوليميريز المتسلسل Polymerase chain reaction (اختصارًا PCR) تقريبًا في كل تطبيقات التقنية الجينية لتضخيم جزء معيّن من DNA. يمكن إنتاج كميّات غير محدودة من جزء DNA من كميّة صغيرة من DNA (وإن كان جزيئًا واحدًا) وبطريقة سهلة وسريعة.
يبيّن الشكل ٣-٦ المراحل المتضمنة في دورة واحدة من تفاعل PCR.
يضاف ما يأتي إلى كل أنبوبة في جهاز PCR:

عيّنة من DNA، وهي جزء DNA المراد تضخيمه.

جزآن قصيران مختلفان من شريط DNA مفرد يعملان كبادئات لإنزيم DNA بوليميريز.

جزيئات حرة من ديوكسي نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs)، والتي تعمل كوحدات أساسية لبناء أشرطة جديدة من DNA.

محلول منظم عندpH 8-7.

محلول من DNA بوليميريز مستقر حراريًا.
يتم تشغيل جهاز PCR ويترك ليعمل. تتطلب كل مرحلة درجة حرارة مختلفة، لذا تُغير أجهزة PCR درجة حرارة المزيج ذاتيًا. الأنابيب صغيرة جدا (تستوعب 0.05mL تقريبًا)، وجدرانها رقيقة جدًا، لذا تتغير درجة الحرارة فيها بسرعة عندما تتغير درجة الحرارة في الجهاز (الصورة ٣-٥).

• المرحلة الأولى التمسخ Denaturation:
  يتم أولا تمسيخ DNA بتسخينه إلى 95°C تقريبًا، الأمر الذي يكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد، ويفصل شريطي DNA أحدهما عن الآخر، لتبقى القواعد مكشوفة (غير مزدوجة).
• المرحلة الثانية (الالتصاق Annealing):
  ترتبط البادئات مع تتابع القواعد على كلا جانبَي DNA الجاري تضخيمه عن طريق تكوين روابط هيدروجينية. وتتطلب العملية وجود البادئات إذ لا يمكن أن يبدأ إنزيم DNA بوليميريز بتكوين DNA بدون وجود شريط يمكن البناء عليه. تتكوّن البادئات غالبًا من 20 زوجًا من القواعد تقريبًا، ذات تتابع مكمل لتتابع القواعد على كلا جانبَي جزء DNA الجاري نسخه. تحتوي البادئات على تتابع قواعد مختلف، حيث ترتبط إحداهما بالشريط ((صعودًا)) وترتبط الأخرى بالشريط ((نزولا» كما في الشكل ٣-٦. يتطلب الارتباط بالبادئات درجة حرارة 60°C تقريبًا.

• المرحلة الثالثة (الإطالة Extension):
  يستخدم إنزيم DNA بوليميريز بعد ذلك dNTPs لتكوين أشرطة جديدة من DNA مقابل تلك المكشوفة. ويتطلب ذلك درجة حرارة 72°C تقريبًا. ويتم الحصول على إنزيم DNA بوليميريز المستخدم في هذه العملية من الكائنات الحية الدقيقة التي تكيّفت للعيش في البيئات الحارة.

في نهاية الدورة الأولى، بعد أن يكون DNA قد تم نسخه، يسخن المزيج مرة أخرى للبدء بالدورة الثانية، والتي ينتج
منها أربعة جزيئات من DNA مزدوج.
Taq بوليميريز هو أول إنزيم DNA بوليميريز مستقر حراريًا يستخدم في PCR. وقد استخلص من البكتيريا المحبة
للحرارة Thermus aquaticus، التي وجدت في الينابيع الحارة في منتزه يلوستون Yellowstone Park في الولايات
المتحدة الأمريكية. يمثل هذا الإنزيم قيمة كبيرة لـ PCR لسببين: الأول لأنه لا يتحطم في مرحلة التمسخ، لذا يجب
ألَّا نستبدله أثناء كل دورة، والثاني، له درجة حرارة مثلى عالية، الأمر الذي يعني أن درجة الحرارة لمرحلة الإطالة
يجب ألّا تنخفض إلى أقل من تلك في عملية الالتصاق، ما يزيد من الكفاءة إلى أقصى حد. العديد من إنزيمات DNA
بوليميريز المختلفة والمستقرة حراريًا متاحة الآن لـ PCR.
يمكنك أن ترى أنه من الناحية النظرية قد يستمر تكرار التفاعل للأبد، مكوّنًا نسخًا أكثر وأكثر، من عدد ضئيل من
جزيئات DNA الأصلية. يمكن استخدام جزيء DNA واحد لإنتاج مليارات النسخ المماثلة في غضون ساعات قليلة.
فقد أدت تقنية PCR إلى إمكانية الحصول على ما يكفي من DNA من عيّنة صغيرة- على سبيل المثال، جزيء مجهري
من قطرة دم تركت في مسرح الجريمة.
تستخدم تقنية PCR الآن بشكل روتيني في علم الطب الشرعي لتضخيم DNA من عيّنات نسيجية تركت في مسرح
الجريمة. وقد أمكن حل العديد من الجرائم بمساعدة PCR، إضافة إلى DNA باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي.

الفصل الكهربائي الهلامي

الفصل الكهربائي الهلامي Gel electrophoresis تقنية تستخدم لفصل جزيئات مختلفة (الصورة ٣-٦). وهي تستخدم على نطاق واسع في تحليل DNA بفصل أجزاء من DNA. تتضمن هذه التقنية وضع خليط من الجزيئات في آبار Wells
تُحفر في هلام وتعرَّض لمجال كهربائي. تعتمد حركة الجزيئات المشحونة داخل الهلام استجابة للمجال الكهربائي على عدد من العوامل، وأكثرها أهمية ما يأتي:

• الشُحنة – إن مجموعة الفوسفات في DNA ذات شحنة سالبة، لذا ستتحرك قطع DNA باتجاه القطب الموجب (+).
• الحجم – تتحرك الجزيئات الأصغر أو الأقصر عبر الهلام بشكل أسرع من الجزيئات الأكبر أو الأطول، وتتناسب
  المسافة التي تقطعها قطعة DNA عكسيًا مع طولها، فكلما كانت أقصر تقطع مسافة أطول عبر الهلام.

الخطوات

1. بعد تحضير الهلام (من أجاروس Agarose مثلًا)، يصبّ محلول منظم في الخزان بحيث يغطي الهلام، ليوفر pH
   ثابت.
2. تستخدم ماصة دقيقة Micropipette لنقل عيّنات DNA إلى جميع الآبار (الصورتان ٣-٦ و٣-٧). تحتوي عيّنات DNA
   على صبغة تتَبُّع Tracking dye.
3. غالبًا ما توضع عيّنة مرجعية بأطوال معروفة من قطع DNA في بئر على أحد جانبَي الهلام أو كلا الجانبَين، ويستخدم بمثابة ((سلّم)) DNA لتحديد أطوال قطع DNA في العيّنات الأخرى (الشكلان ٣-٧ و٣-٨).
4. توصل حزمة بطاريات بأقطاب كهربائية. يكون القطب السالب في الطرف نفسه للآبار المحملة ب DNA (الشكل
   ٢-٧).
5. تُظهر صبغة التَتَبُّع المسافة التي تحركتها المادة في العيّنات عبر الهلام.
6. يسكب المحلول المنظم خارجًا، وتضاف صبغة مناسبة إلى الهلام. تشطف الصبغة لتكشف عن قطع عبر الهلام التي
   تمثل مواقع قطع DNA. يمكن تحديد أطوال قطع DNA بمقارنتها مع ((سلّم)) DNA على جانب الهلام.